Walidacja jest nieodzownym elementem akredytacji laboratorium i oznacza proces potwierdzenia, że wybrane metody spełniają wymagania dotyczące ich zastosowania oraz są w stanie wykryć badany czynnik z odpowiednią precyzją i dokładnością.

Postępowanie walidacyjne

ˇ Sformułowanie zadania określonego przez klienta
ˇ Przeprowadzenie charakterystyki metody badawczej (określenie wartości
liczbowych cech charakterystycznych metody)
ˇ Porównanie wartości cech charakterystycznych metody badawczej z wymaganiami sformułowanymi w stosunku do metody badawczej
ˇ Określenie przydatności metody badawczej do rozwiązania zadania ( stwierdzenie przydatności "metoda spełnia wymagania" albo poszukanie innej metody badawczej lub zmiana wymagań stawianych metodzie lub rezygnacja ze zlecenia.)
ˇ W przypadku braku specyfikacji, walidacja polega na scharakteryzowaniu wartości wybranych cech metody w warunkach laboratorium.

Wybór techniki przewidzianej do charakterystyki metody badawczej zależy od możliwości:

ˇ wykorzystania wzorców i materiałów odniesienia
ˇ zastosowania metody porównawczej
ˇ wykorzystania badań międzylaboratoryjnych.

Techniki ustalania charakterystycznych cech metody badawczej:
ˇ Systematyczne badanie czynników wpływających na wynik badania.
ˇ Porównanie z wzorcami odniesienia połączone z systematycznym badaniem czynników wpływających na wynik.
ˇ Porównawcze badania międzylaboratoryjne przy użyciu tej samej metody badawczej
ˇ Porównanie wyników uzyskanych innymi metodami badawczymi.

W czasie charakteryzacji metody badawczej ustalane są takie parametry metody jak:

ˇ granice wykrywalności
ˇ granice oznaczalności
ˇ zakres metody
ˇ czułość
ˇ selektywność
ˇ specyficzność
ˇ liniowość
ˇ precyzja w warunkach powtarzalności
ˇ precyzja w warunkach odtwarzalności
ˇ poprawność metody
ˇ niepewność wyniku badania.


Parametry charakterystyki metody i szacowanie niepewności w analizach fizyko-chemicznych i mikrobiologicznych.

Zakres roboczy metody - zakres stężeń analitu powyżej którego metodę można stosować. Zakres ten można określić jako zakres stosowania, w którym można osiągnąć akceptowalną poprawność i precyzję. W przypadku analizy stężeń minimalnych w badanym materiale dolna granica zakresu roboczego odpowiada zwykle granicy oznaczania ilościowego bądź wartości granicy wykrywalności.

Granica oznaczalności- najniższe stężenie obiektu (substancji) badanej (mierzonej, oznaczanej, analizowanej) lub najmniejsza liczba organizmów, jakie można oznaczyć na akceptowalnym poziomie powtarzalności-precyzji i poprawności.
Miarą granicy oznaczalności może być wynik odpowiadający średniemu stężeniu badanej substancji w ślepej próbce z uwzględnieniem odchylenia standardowego rozrzutu przypadkowego wyników wielokrotnego badania ślepej próbki. Granicę oznaczalności analizowanej substancji określa się przez badanie ślepej próby. Jeżeli przygotowanie próby ślepej nie jest możliwe, wykonuje się analizę na próbie o bardzo małym stężeniu. Granica oznaczalnosci jest to szesciokrotnosć odchylenia standardowego i wyznacza się według wzoru : GO = x + 6S. Granicę oznaczalności w oznaczeniach mikrobiologicznych wyznacza się według wzoru:
1
X= (RSD)2

Granica wykrywalności - najmniejsze stężenie obiektu (substancji) badanej (mierzonej, oznaczanej, analizowanej itp.) lub najmniejsza liczba organizmów jaką można wykryć jakościowo w badanej próbce daną metodą badawczą.
Miarą granicy wykrywalności może być wynik odpowiadający średniemu stężeniu badanej substancji w ślepej próbce z uwzględnieniem odchylenia standardowego rozrzutu przypadkowego wyników wielokrotnego badania ślepej próbki. Granicę wykrywalności wyznacza się na podstawie 20 wyników badań prób ślepych według wzoru: GW = x + 3S.
W oznaczeniach mikrobiologicznych za granicę wykrywalności mikroorganizmów daną metodą może być uważana objętość , w której można wykryć jeden mikroorganizm lub najmniejsza wykrywalna liczba mikroorganizmów zawartych w danej objętości próby.

Precyzja - stopień zgodności między niezależnymi wynikami badania w określonych warunkach.
Miary precyzji to:
- powtarzalność
- odtwarzalność
- względne odchylenie standardowe

Powtarzalność - rozrzut przypadkowy wyników w ciągu wielokrotnego (oznaczania wartości) badania tej samej cechy (właściwości) tego samego obiektu w warunkach powtarzalnych.
Warunki powtarzalne to:
- ta sama metoda badawczo-pomiarowa
- w tym samym laboratorium
- ta sama osoba badająca
- na tym samym urządzeniu badawczo-pomiarowym
- przy użyciu tych samych czynników pomocniczych
- w tych samych warunkach danego laboratorium.
Precyzja w warunkach powtarzalnosci
Jest to najmniejsza oczekiwana precyzja , która może dostarczyc informacji o rodzaju oczekiwanej zmiennosci gdy metodę stosuje jedn analityk za pomoca jednego przyrzadu w krótkim czasie.
W celu oznaczenia powtarzalnosci wykonuje się w możliwie krótkim przedziale czasu co najmniej siedem analiz ( każda w dwóch powtórzeniach). Przed wykonaniem obliczenia odchylenia standardowego należy sprawdzić zbiory wyników analiz xa i xb (oddzielnie) na obecność błędów grubych przy pomocy testu Dixona.
Z otrzymanych wyników obliczyć odchylenie standardowe z rozstępu (xia - xib) za pomocą wzoru:


gdzie:
m - ilość analiz dwukrotnych.
Powtarzalność dla metod badawczych, w których przewidziano wykonanie dwóch (równoległych) analiz (pomiarów) danej próbki (obiektu) wyraża się równaniem:


Wartość statystyki t-Studenta należy przyjąć właściwą dla danej liczby stopni swobody f = m i poziomu istotności a = 0,05.

Powtarzalność dla metod badawczych, w których przewidziano wykonanie jednej analizy (pomiaru) danej próbki (obiektu) wyraża się równaniem:


Odchylenie standardowe s obliczyć ze wzoru:

gdzie:
- uzyskana wartość średnia stężenia próbek kontrolnych
n - ilość próbek kontrolnych

Wartość statystyki t-Studenta należy przyjąć właściwą dla danej liczby stopni swobody
f = n-1 i poziomu istotności a = 0,05.

W oznaczeniach mikrobiologicznych miarą precyzji jest względne odchylenie standardowe które wyraża się wzorem :
S
RSD= -
X

S- odchylenie standardowe
_
X - uzyskana wartość średnia

Gdy chcemy RSD wyrazić w procentach mówimy o współczynniku wariancji (zmiennosci)

CV%= RSD x 100%


Odtwarzalność -rozrzut przypadkowy wyników w ciągu wielokrotnego (oznaczania wartości) badania tej samej cechy (właściwości) tego samego obiektu w warunkach odtwarzalnych tzn:
- ta sama lub odmienna metoda badawczo-pomiarowa
- zastosowana w rożnych laboratoriach
- przez różne osoby badające
- na różnych urządzeniach badawczo-pomiarowych
- przy użyciu różnych czynników pomocniczych
- w różnych warunkach różnych laboratoriów.
Badanie precyzji w warunkach odtwarzalności polega na porównaniu serii własnych wyników z wynikami innych laboratoriów.(badania międzylaboratoryjne).
Jeżeli metodę ocenia się w warunkach odtwarzalności to odchylenie standardowe odtwarzalności oblicza się według wzoru:


Poprawność (odchylenie systematyczne) - określa jak blisko wartości prawdziwej znajduje się średnia wartość szeregu wyników. Za miarę poprawności przyjmuje się różnicę pomiędzy wartością badaną a wartością rzeczywistą, której nośnikiem jest wzorzec lub substancja odniesienia. Poprawność metody powinna zostać sprawdzona poprzez analizę odpowiednich materiałów referencyjnych z certyfikowaną zawartością oznaczanego składnika.
Za miarę poprawności przyjmuje się wartość wynikającą z podzielenia sumy różnic pomiędzy wartością znaną (certyfikowaną) a wartością wyznaczoną przez ilość pomiarów (minimum osiem pomiarów).
W przypadku braku odpowiednich materiałów możliwe jest również oszacowanie poprawności na podstawie oznaczenia dodatku wzorca do naturalnych próbek o znanej zawartości badanego analitu.
Badanie polega na dodaniu określonej ilości badanego analitu do próbek rzeczywistych o znanej, niewielkiej zawartości oznaczanego składnika.
Stężenie jednej grupy próbek powinno mieścić się po fortyfikacji próbek rzeczywistych w zakresie stężeń nieco powyżej granicy oznaczalności tzn. ok. 20% zakresu metody, natomiast stężenie drugiej grupy próbek powinno wynosić ok. 80% zakresu metody.
Do próbek rzeczywistych wchodzących w skład jednej grupy powinna być dodana jednakowa ilość badanego analitu.
Rejestrujemy wartość sygnału dla określonej próbki bez dodatku analitu (cz) oraz wartość sygnału dla próbki z dodatkiem analitu (cm). Z różnicy wartości (cm - cz) określamy stężenie dodanego analitu (wartość wyznaczona W1).
Dla każdego poziomu stężeń należy wykonać nie mniej niż osiem pomiarów.
W celu sprawdzenia, czy dany wynik W1 jest obciążony błędem grubym zastosować test Dixona.
Za miarę poprawności metody dla 20% lub 80% zakresu przyjąć wartość wynikającą z podzielenia sumy różnic pomiędzy wartością znaną a wartością wyznaczoną przez ilość pomiarów. Wartość każdej różnicy uzyskać odejmując zawsze od wartości znanej wartość wyznaczoną.
Odzysk - badanie odzysku prowadzone jest w celu stwierdzenia
ewentualnych strat analitu w toku analizy oraz wpływu matrycy na wynik badania.
Jednym ze sposobów oznaczenia odzysku jest dodanie analitu w róznych steżeniach do próbki analitycznej i oznaczenie jej według procedury okreslonej metody. Można rowadzić badania za pomoca materiałów odniesiania certyfikowanych jeżeli odpowiednie sa doatępne a jeżeli nie to korzystamy za materałów rzeczywistych.
W celu zbadania odzysku:
ˇ Oznaczyć stężenie badanego wskaźnika w próbce rzeczywistej C0
ˇ Dodać do próbki rzeczywistej określoną ilość roztworu wzorcowego o znanym stężeniu badanego wskaźnika
ˇ Oznaczyć stężenie badanego wskaźnika w próbce wzbogaconej CT
ˇ Z ilości dodanego wzorca obliczyć stężenie wzbogacenia Cw
ˇ Obliczyć odzysk wg wzoru

Odzysk[%] = *100


Czułość - jest to róznica stężenia oznaczanego składnika odpowiadajaca najmniejszej róznicy odpowiedzi jaka można wykryć. Jeżeli zależnosć odpowiedzi od stężenia jest liniowa to znaczy zakres metody jest liniowy , wówczas czułosć jest potrzebnym parametrem do obliczania i wykorzystania we wzorach. Miarą czułosci metody jest współczynnik nachylenia krzywej wzorcowania b.
Czułość metody (stałą b) obliczyć wg wzoru:

gdzie:
xi - wartość wskazania przyrządu pomiarowego
a - stała
b - współczynnik kierunkowy prostej


Selektywność - zdolność metody do rozróżniania i oznaczania pewnej cechy organizmu lub składnika w złożonej matrycy lub mieszance bez znaczących zakłóceń ze strony pozostałych składników mieszanki.
Specyficzność- zdolność metody do selekcji i wyróżniania poszukiwanych mikroorganizmów ze wszystkich innych w tym samym środowisku.
Liniowość jest to zaleznosć sygnału odpowiedzi od stężenia analitu lub od wartosci ,gdy jest ona liniowa. Jest to przebieg funkcji wzorcowania odpowiadający prostej regresji.Oznacza się przez analizę próbek o stężeniach substancji analizowanych pokrywających zalecany zakres metody.
Przyjmuje się, że dana metoda badawcza jest liniowa w zakresie krzywej wzorcowej, dla której współczynnik korelacji jest większy lub równy 0,999.
Współczynnik korelacji obliczyć ze wzoru:


Linię prostą, która najlepiej pasuje do punktów doświadczalnych przedstawia następujące równanie:
y = bx + a
gdzie:
y - wartość wskazania przyrządu pomiarowego,
x - ilość (stężenie) analitu,
b - współczynnik kierunkowy prostej (współczynnik kierunkowy prostej równa się stosunkowi różnicy rzędnych do różnicy odciętych dwóch dowolnych punktów prostej y = bx + a ,inaczej współczynnik nachylenia krzywej
a - współczynnik przesunięcia

Niepewność pomiaru - parametr związany z wynikiem pomiaru charakteryzujący rozrzut wartości, które można w uzasadniony sposób przypisać wielkości mierzonej. wynik postępowania mającego na celu oszacowanie przedziału wewnątrz którego znajduje się wartość prawdziwa wielkości mierzonej, zwykle z daną wiarygodnością (PN-ISO 10012-1998r).
Czynniki wpływające na niepewność pomiaru :
ˇ człowiek - brak kompetencji, brak doświadczenia, nieprzestrzeganie instrukcji, nieprawidłowa obsługa, nieuwaga, stres, zmęczenie;
ˇ media- czystość wody chemiczna, bakteriologiczna, czystość gazów i powietrza, wahania napięcia elektrycznego
ˇ środowisko- oświetlenie, temperatura, wilgotność, zapylenie pomieszczenia, drgania, hałas, pole elektromagnetyczne
ˇ środki pomocnicze, narzędzia - odczynniki przeterminowane, brudne naczynia
ˇ próbki - zbyt mało reprezentatywne względem ilości, miejsca
ˇ poboru, warunki pobrania, transport, przechowywanie.
ˇ metoda badawcza- niewłaściwie dobrana, za mało precyzyjna, nieselektywna, niespecyficzna, mało odporna na czynniki zewnętrzne lub na matrycę.
ˇ urządzenia i instrumenty - niewłaściwe wzorcowanie
Niepewność wyniku pomiaru wyrażona jako odchylenie standardowe nosi nazwę niepewności standardowej. Wyróżnia się dwa typy szacowania niepewności standardowej
Typ A - ocena niepewności poprzez statystyczną analizę wyników serii pomiarów
Typ B- ocena niepewności za pomocą:
- wyników wcześniejszych pomiarów
- doświadczenia i wiedzy dotyczących zachowania stosowanego przyrządu pomiarowego
- wyników uzyskanych z wzorcowania
- danych producenta na temat przyrządu pomiarowego
Niepewność standardową złożoną wyrażamy wzorem:

Uc=? u12(X1) + u22(X2) .... + un2( Xn)

Gdy znana jest niepewność standardowa złożona możemy wyrazić niepewność rozszerzoną U. Niepewność rozszerzoną otrzymuje się mnożąc niepewność standardową przez współczynnik k.

U = kˇ uc (y)


Tryb postępowania w celu oszacowania niepewności pomiaru:

ˇ ustalić zależność między wartością mierzoną(wyjściową) Y a wielkościami X1
Y= f ( X1,X2, ....Xn )
ˇ rozpoznać wszystkie źródła błędów systematycznych i wprowadzić poprawki
ˇ ustalić wszystkie cechy charakterystyczne niepewności typu A i typu B
ˇ oszacować wielkości składników niepewności pochodzących z zidentyfikowanych źródeł i wyrazić jako niepewności standardowe.
ˇ odnieść niepewności standardowe u(xi) wszystkich wielkości wejściowych do wielkości wyjściowej przez obliczenie odpowiednich pochodnych cząstkowych
ˇ obliczyć niepewność standardową złożoną wielkości wyjściowej
ˇ obliczyć niepewność rozszerzoną przez pomnożenie całkowitej niepewności rozszerzonej przez odpowiedni współczynnik k
ˇ sporządzić budżet niepewności dzieląc proces analizy, od planowania poboru prób do otrzymania wyników, na operacje jednostkowe obliczyć lub oszacować niepewność dla poszczególnych operacji,
obliczyć niepewność całkowitą
Istnieją również inne metody podawania wartości niepewności wyniku. Bazują one na odchyleniu standardowym odtwarzalności lub powtarzalności. Niepewność pomiaru jest wartością powstałą z pomnożenia odchylenia standardowego w zakresie powtarzalności lub odtwarzalności x 2 ( przy poziomie ufności 0,05)
W przypadku zredukowania zmienności do poziomu powtarzalności uzyska się pewność, że większość występujących błędów znajdzie pokrycie w oszacowanej wartości. W tej sytuacji zaleca się,aby laboratorium określiło współczynnik powtarzalności, co pozwoli obliczyć niepewność pomiaru ( U).
U = 2 Sr
Jeżeli badania wykonywane były w warunkach odtwarzalności to :
U = 2 SR
W badaniach biologicznych wykonuje się budżet niepewności metodą szacunkową na podstawie doświadczenia pracowników. Metoda polega na dokładnym uwzględnieniu kolejnych czynności podczas analizy i określeniu szacunkowo niepewności w warunkach optymalnych ( niepewność minimalna ) i warunkach ekstremalnych( niepewność maksymalna). Niepewności cząstkowe podstawia się do wzoru: